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中科院神經(jīng)所在世界上首次獲得基因敲入的食蟹猴

中科院神經(jīng)科學(xué)研究所、腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室楊輝研究組與蘇州非人靈長(cháng)類(lèi)研究平臺孫強團隊合作,利用了一種以同源臂介導的末端接合(HMEJ)為基礎的基因敲入策略,在世界上首次獲得了基因敲入的食蟹猴。1月12日,這一重要研究成果以題為《運用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得基因敲入食蟹猴》在線(xiàn)發(fā)表于《細胞研究》期刊。

由于基因修飾猴模型可以用于模擬人類(lèi)疾病癥狀,因此它可以作為研究人類(lèi)疾病機制和推進(jìn)臨床治療的工具。然而,由于普通猴具有繁殖周期長(cháng)(5-6年一代),幼仔數量少(每胎一只)以及基因編輯效率低等特點(diǎn),導致構建靶向基因編輯猴具有很大的困難和挑戰性。最近的一些研究表明,CRISPR/Cas9系統可以用于構建基因敲除猴。然而,與基因敲除相反,由于種種原因例如效率低,到目前為止仍然還沒(méi)有基因成功敲入猴的報道。

基于實(shí)驗室之前的研究,同源臂介導的末端接合(HMEJ)的方法可以有效地在獼猴胚胎上實(shí)現高效的靶向基因整合。研究人員進(jìn)一步優(yōu)化受精卵注入條件,包括供體質(zhì)粒濃度以及注射劑量,期望在提高敲入效率的同時(shí)保持正常的胚胎發(fā)育,進(jìn)而獲得基因敲入的猴子。具體來(lái)說(shuō),研究人員在A(yíng)ctb (β-actin)位點(diǎn)插入p2A-mCherry以實(shí)現mCherry在A(yíng)ctb啟動(dòng)子的控制下表達。在經(jīng)歷完整的懷孕周期后,研究人員成功地獲得了一對雙胞胎猴(#1,雄;#2,雌)和三只單胎的雌性猴(#3、#4和#5)。通過(guò)直接表皮熒光觀(guān)察兩只新生猴(#1,#5)的腳趾發(fā)現,與野生型相比,#1和#5展現出mCherry熒光。對兩只死亡雌猴子(#2,#3)的各個(gè)組織進(jìn)行切片觀(guān)察,發(fā)現尾巴、腳趾、心臟、肌肉、心臟、腎、大腦和卵巢均顯示出不同嵌合程度的mCherry表達。值得注意的是,研究人員在卵巢的大部分區域都檢測到mCherry的表達,說(shuō)明基因敲入猴子具有生殖系傳遞的可能性。所有組織的PCR鑒定測序結果都表明在5’和3’連接處的整合是正確的。此外,Southern印跡分析進(jìn)一步證實(shí)# 2和# 3猴的基因整合是正確的且沒(méi)有額外的基因隨機整合。

研究人員利用CRISPR/Cas9介導的HMEJ策略,通過(guò)一細胞胚胎注射首次成功地獲得了基因靶向整合的食蟹猴?!睂?zhuān)家表示,基于其強大的DNA敲入效率和高保真性,HMEJ介導的敲入策略為構建靶向基因修飾的猴模型提供了可能性。

據介紹,這項工作由助理研究員姚璇、博士后劉真與研究生王興在靈長(cháng)類(lèi)疾病模型研究組楊輝研究員與蘇州非人靈長(cháng)類(lèi)研究平臺主任孫強博士的指導下完成。并得到國家科技重大專(zhuān)項,中科院戰略性先導科技專(zhuān)項, 國家高科技研發(fā)項目國家自然科學(xué)基金會(huì ), 中國青年千人計劃, 中國科學(xué)院重大突破項目、國家關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)項目, 上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì )項目,中科院百人計劃等項目的資助。


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